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Revista de la Asociación Colombiana de Ciencias Biológicas
issn impreso 0120-4173, issn en línea 2500-7459
Extracción de carotenoides Cuantifi cación de β-caroteno por HPLC
Se seleccionó un representante de cada morfotipo y se Por medio de cromatografía líquida de alto desempe-
cultivó por duplicado durante cinco días a temperatu- ño (HPLC) se realizó la cuantifi cación del contenido de
ra ambiente en medio solido MMS (Glucosa 1% (p/v), β-caroteno presente en las representantes de cada mor-
extracto de levadura 0,1% (p/v), (NH ) SO 0,2% (p/v)
4 2 4 fotipo. Para la determinación cuantitativa de los caro-
(Panreac, Barcelona, España), KH PO (Panreac, Bar-
2 4 tenoides se utilizó el área del pico cromatográfi co para
celona, España), MgSO •7H O 0,05% (p/v) (Panreac,
4 2 correlacionarlo con la concentración del analito en la
Barcelona, España), CaCl •2H O 0,0075% (p/v) (Schar-
2 2 muestra. Como las áreas de los picos cromatográfi cos
lau, Barcelona, España) y Agar Bacteriológico 2% p/v de las muestras quedaron comprendidas entre las áreas
(Panreac, Barcelona, España)). Para la extracción de de los picos cromatográfi cos de los estándares, se usó
pigmentos se usaron dos tubos de microcentrífuga para para determinar la ecuación de la recta y su concentra-
cada levadura. A cada tubo se le adicionó 1 mL de di- ción. Se cuantifi có el β-caroteno por comparación del
metilsulfóxido (DMSO, Panreac, Barcelona, España) y tiempo de retención y la absorbancia espectral del pico
se le añadió la biomasa de las cajas de Petri. Luego, detectado a 450 nm fue interpolada con la curva de ca-
se colocó en el vortex a máxima velocidad por 5 min. libración, utilizando β-caroteno (Sigma, St. Louis, MO)
Posteriormente, se colocaron los tubos en baño maría a como estandar.
55°C 10 minutos y luego 10 min en vortex, repitiendo
este proceso durante una hora. Al cabo del tiempo se Cinética de crecimiento y selección cualitativa
centrifugaron a 8000 r.p.m durante 5 min para después Se tomó un aislado del morfotipo seleccionado que pro-
trasvasar el sobrenadante a un tubo cónico refrigerado y dujo mayor concentración de β-caroteno y rendimiento
cubierto con papel aluminio a 0°C (protegido de la luz). de la extracción de pigmentos, el cual se agregó en un
Al precipitado, se le adicionó 1 mL de acetona (Chemi, tubo con 3 mL de medio GYP, y se dejó crecer durante
Medellín, Colombia) a 5 °C y se agitó durante 5 mi- 2 a 3 días incubado a temperatura ambiente (por tripli-
nutos en el vortex, al terminar el tiempo se centrifugo cado). Se estandarizó un inóculo a 1x10 cel/mL, en 100
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a 8000 r.p.m durante 2 minutos (este procedimiento se mL de medio mínimo sintético MMS líquido. La cinéti-
repitió hasta que no se observaron más pigmentos en el ca se realizó durante cinco días a temperatura ambiente
pellet) y el sobrenadante se transfi rió a un tubo cónico y se tomaron muestras a las 0, 3, 6, 9, 24, 48, 72, 96 y
refrigerado. Al tubo cónico refrigerado con los pigmen- 120 horas tomando una alícuota de 1 mL en tubos de
tos se agregó 1,5 mL de solución saturada de NaCl y 1 microcentrífuga previamente pesados por duplicado. Se
mL de hexano (Merck, Darmstadt, Alemania), se agitó evaluaron las siguientes variables: turbidez (absorban-
en el vortex durante 1 minuto y se centrifugó a 4500 cia a 600 nm), contenido de sustrato a través del método
r.p.m. por 5 minutos (con hexano y los pigmentos). Se DNS (13), biomasa seca (g/L) y producción de carote-
transfi rió la fase que contiene hexano a un frasco color nos totales (µg/mL).
ámbar/caramelo. La cuantifi cación de los pigmentos ex-
traídos se desarrolló por la técnica de espectrofotome- Identifi cación mediante técnicas moleculares
tría en donde el blanco fue el hexano grado cromatográ- El ADN genómico de las levaduras fue extraído utili-
fi co. El rendimiento de carotenoides totales, en µg/g, se zando el Kit GeneJet (Thermo Fisher Scientifi c). La
determinó empleando la ecuación 1 (12). concentración y calidad del ADN obtenido se verifi ca-
ron mediante electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v),
teñidos con GelRed y visualizados en luz UV con el
fotodocumentador SmartDoc 2.0 (Accure). Se ampli-

(ecuación 1) fi có la región ribosómica ITS1-5.8S-ITS2 utilizando
PCR, con los cebadores ITS1 e ITS4. Las condiciones
de amplifi cación fueron las siguientes: un ciclo inicial
• ABS = absorbancia a 485 nm
a 94°C durante 5 min, 35 ciclos a 94°C durante 15 s,
• Volumen = volumen de cultivo en mL 55°C durante 45 s, 72°C durante 90 s y un ciclo de ex-
• CE = coefi ciente de extinción del carotenoide en tensión fi nal a 72°C por 6 min. Seguidamente, los pro-
hexano = 2592
ductos de PCR se examinaron por electroforesis en un
• Biomasa = peso seco de la biomasa
gel de agarosa al 1,5% (p/v) a 50 V durante 45 min y
se verifi có visualizándolo bajo luz UV usando el foto-
documentador SmartDoc 2.0 (Accure). Los productos

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Rev. Asoc. Col. Cienc.(Col.), 2020; 32: 103-114